El receptor de glicina humano (con tres subunidades α y dos β) se utilizó como nanopatrón. Se midió la eficiencia de fotoactivación a nivel de una sola molécula uniendo proteínas fluorescentes a estas subunidades. Fuente: ICFO
Para comprender el funcionamiento de las proteínas es fundamental saber cuántas se unen entre sí a escala nanométrica. Además, algunas deben encontrarse en un estado oligomérico –con determinados radicales asociados– para ser funcionales, aunque la ‘oligomerización’ también puede conducir a enfermedades.
Determinar la estequiometría –proporciones entre reactivos y productos– de las proteínas y seguir los cambios en el equilibrio entre las monoméricas (con un solo monómero), diméricas y multiméricas ayuda a los científicos a ver las diferencias entre una célula sana y otra enferma.
Ahora, el grupo de investigación de biofisica e imagen de fluorescencia avanzada del Instituto de Ciencias Fotónicas (ICFO) de Barcelona ha cuantificado la eficiencia de fotoactivación de todas las ‘proteínas fluorescentes fotoactivables irreversibles’ y establecido un marco de referencia para determinar la estequiometría de las proteínas.
El equipo, dirigido por la doctora Melike Lakadamyali, utilizó un nanopatrón de estequiometría conocido (el receptor de glicina humano, expresado en ovocitos de Xenopus) para estudiar varias proteínas fluorescentes y conocer el porcentaje de proteínas que se fotoactivaron. Los resultados se publican en Nature Methods.
En los últimos años el conteo molecular ha avanzado gracias al descubrimiento de las proteínas fluorescentes fotoactivables y el desarrollo de la microscopía de superresolución. Las proteínas fluorescentes fotoactivables cambian sus propiedades de fluorescencia de oscuro a brillante cuando son expuestas a la luz (por ejemplo, luz láser).
Pero este conteo no es fácil por, entre otras razones, porque hasta no hace mucho no se sabía si todas las proteínas fluorescentes se volvían brillantes al ser expuestas al láser. El fallo en fotoactivarse conlleva a contar una menor cantidad de proteínas, ya que aparecerían oscurecidas y nunca resaltarían en la imagen.
Determinar la estequiometría –proporciones entre reactivos y productos– de las proteínas y seguir los cambios en el equilibrio entre las monoméricas (con un solo monómero), diméricas y multiméricas ayuda a los científicos a ver las diferencias entre una célula sana y otra enferma.
Ahora, el grupo de investigación de biofisica e imagen de fluorescencia avanzada del Instituto de Ciencias Fotónicas (ICFO) de Barcelona ha cuantificado la eficiencia de fotoactivación de todas las ‘proteínas fluorescentes fotoactivables irreversibles’ y establecido un marco de referencia para determinar la estequiometría de las proteínas.
El equipo, dirigido por la doctora Melike Lakadamyali, utilizó un nanopatrón de estequiometría conocido (el receptor de glicina humano, expresado en ovocitos de Xenopus) para estudiar varias proteínas fluorescentes y conocer el porcentaje de proteínas que se fotoactivaron. Los resultados se publican en Nature Methods.
En los últimos años el conteo molecular ha avanzado gracias al descubrimiento de las proteínas fluorescentes fotoactivables y el desarrollo de la microscopía de superresolución. Las proteínas fluorescentes fotoactivables cambian sus propiedades de fluorescencia de oscuro a brillante cuando son expuestas a la luz (por ejemplo, luz láser).
Pero este conteo no es fácil por, entre otras razones, porque hasta no hace mucho no se sabía si todas las proteínas fluorescentes se volvían brillantes al ser expuestas al láser. El fallo en fotoactivarse conlleva a contar una menor cantidad de proteínas, ya que aparecerían oscurecidas y nunca resaltarían en la imagen.
Eficiencia de fotoactivación
Pero al medir la eficiencia de fotoactivación, así como otros factores fotofísicos como el parpadeo, el grupo pudo determinar qué proteínas son las más adecuadas para el conteo molecular y encontró que ninguna es perfecta. Por tanto, el estudio destaca la importancia de la eficiencia de fotoactivación para interpretar correctamente la información cuantitativa en el conteo de proteínas.
Lakadamyali señala en la nota de prensa de ICFO, recogida por SINC: “Actualmente estamos trabajando con proteínas fluorescentes imperfectas. Sin embargo, al existir ahora una manera robusta para caracterizar la eficiencia de fotoactivación, el futuro trabajo de ingeniería de proteínas fluorescentes probablemente se centrará en la optimización de este parámetro para generar proteínas fluorescentes más adecuadas en el conteo molecular utilizando técnicas de superresolución".
El equipo combina varias técnicas de imagen vanguardistas a nivel de una sola molécula para estudiar cómo la organización de proteínas, su dinámica y estequiometría se vinculan al funcionamiento de proteínas en procesos biológicos fundamentales, como el transporte intracelular, los trastornos neurológicos autoinmunes o la reprogramación de células madre.
Pero al medir la eficiencia de fotoactivación, así como otros factores fotofísicos como el parpadeo, el grupo pudo determinar qué proteínas son las más adecuadas para el conteo molecular y encontró que ninguna es perfecta. Por tanto, el estudio destaca la importancia de la eficiencia de fotoactivación para interpretar correctamente la información cuantitativa en el conteo de proteínas.
Lakadamyali señala en la nota de prensa de ICFO, recogida por SINC: “Actualmente estamos trabajando con proteínas fluorescentes imperfectas. Sin embargo, al existir ahora una manera robusta para caracterizar la eficiencia de fotoactivación, el futuro trabajo de ingeniería de proteínas fluorescentes probablemente se centrará en la optimización de este parámetro para generar proteínas fluorescentes más adecuadas en el conteo molecular utilizando técnicas de superresolución".
El equipo combina varias técnicas de imagen vanguardistas a nivel de una sola molécula para estudiar cómo la organización de proteínas, su dinámica y estequiometría se vinculan al funcionamiento de proteínas en procesos biológicos fundamentales, como el transporte intracelular, los trastornos neurológicos autoinmunes o la reprogramación de células madre.
Referencia bibliográfica:
Nela Durisic, Lara Laparra-Cuervo, Ángel Sandoval-Álvarez, Joseph Steven Borbely, Melike Lakadamyali. Single molecule evaluation of fluorescent protein photoactivation efficiency using an in vivo nanotemplate. Nature Methods (2014). DOI: 10.1038/nmeth.2784
Nela Durisic, Lara Laparra-Cuervo, Ángel Sandoval-Álvarez, Joseph Steven Borbely, Melike Lakadamyali. Single molecule evaluation of fluorescent protein photoactivation efficiency using an in vivo nanotemplate. Nature Methods (2014). DOI: 10.1038/nmeth.2784